Laboratorio Analisi - Onco-ematologia

Pannello

(Costo reagenti)*

Varianti geniche indagate (rs code)

Metodica di elezione/

Tempi referto

Note su prelievo

Significatività clinica e razionale scientifico

ONCOEMATOLOGIA: TEST DI DIAGNOSI SINDROMI LINFOPROLIFERATIVE (vedi anche singolo test per il follow up)

Sindromi Linfoproliferative B

Riarrangiamento clonale B VDJ catena pesante delle Immunoglobuline IgH

Elettroforesi capillare o PCR

PCR+Nested

(BIOMED2

Aspirato midollare

Sangue, agoaspirato ecc. in EDTA

a +4°C

Durante la differenziazione dei linfociti B il riarrangiamento dei geni delle immunoglobuline crea sequenze uniche di DNA. Tali riarrangiamenti sono sfruttati come marker clonali nelle malattie linfoproliferative. Il test di riarrangiamento per  le linfopatie-B permette di identificare, mediante l’uso della Polymerase Chain Reaction (PCR), i riarrangiamenti della catena pesante (IgH). I primers utilizzati sono: Fr2A e Fr3A, omologhi alle sequenze conservate delle regioni “ framework II-III”, e LJH e VLJH della regione “joining” (JH). La monoclonalità in una popolazione di cellule B è indicata dalla presenza di un singolo distinto frammento di amplificazione dopo elettroforesi su gel di agarosio.

Sindromi Linfoproliferativa  T

Riarrangiamento clonale T

Del recettore TCR alfa/beta e del TCR gamma/delta

Elettroforesi capillare o PCR

Aspirato midollare

Sangue, agoaspirato ecc. in EDTA

a +4°C

Il test per la monoclonalità T, permette di identificare, mediante l’uso della Polymerase Chain Reaction (PCR), iriarrangiamenti del gene _ del recettore delle cellule T (TCR_ in linfociti normali e neoplastici. I primers utilizzati sono: TCR_V2-V3-V4-V5- V8-V9-V10-V11-V12, omologhi ad ogni segmento TCR_ V e JGT1-2-3-4_omologhi ai segmenti  joining)”. Inoltre è indispensabile identificare anche i meno probabili riarrangiamenti 

ONCOEMATOLOGIA: TEST DI DIAGNOSI SINDROMI MIELOPROLIFERATIVE (vedi anche singolo test per il follow up)

Sindromi Mieloproliferative

costi

BCR/ABL

Jak2V617FMPL

CALR

JAK2ex12 seq

BCR/ABL Quantitatitativo

t(9;22)BCR/ABL Major (p210), Minor (p190), micro (p230)

–in caso negativo si procede (su richiesta esplicita) ed ad un costo aggiuntivo : per

–JAK2 V617F

-mutazioni di Calreticulina esone 9

– Mutazioni di MPL (trombocitemie)

-sequenziamento Esone 12 Jak

Per cui tutto il pannello avrebbe un costo di 100 (BCR/Abl)+50 Jak2V617F+ 50 CALR eson9 + 50 (MPL)+ 50 Jak2 ex12 sequenza, Totale= 300,00

In caso di positivita al t(9;22) si procede all’analisi Quantitativa

(costo addizionale

RT- PCR + Nested PCR

Sequenziamento diretto

Real time PCR secondo le direttive di European LeukemiaNET

Aspirato midollare

Sangue,  ecc. in EDTA

a +4°C

Il test ricerca mutazioni che sono causa accertata di una espansione clonale della linea mieloide. Tale alterazione è stata descritta nel 70% circa dei casi di Policitemia Vera e nel 60% circa dei casi di Trombocitemia Essenziale (Vannucchi et al. Blood 2007). La mutazione V617F del gene JAK-2 è infine stata descritta anche in una percentuale minore (circa il 30%) di casi di Mielofibrosi Idiopatica.  Il cromosoma Philadelphia (Ph), descritto da tempo nelle cellule della leucemia mieloide cronica (CML), si ritrova anche in circa il 2-10% di leucemie linfoblastiche acute (ALL) della infanzia e nel 20-50% dell’adulto, con un incidenza che aumenta progressivamente con l’età. Il cromosoma Philadelphia è un cromosoma 22 aberrante formatosi a seguito di una traslocazione 9:22. La translocazione Ph produce sempre la congiunzione della sequenza 3 ‘del proto-oncogene c- ABL sul cromosoma 9 alla sequenza 5’ del gene BCR sul cromosoma 22. La conseguenza di questa traslocazione è la formazione di un mRNA c-abl/BCR ibrido e di una proteina ibrida. Nella CML i trascritti di fusione codificano per una proteina BCR-ABL di 210 Kda, chiamata p210BCR/ABL. Circa il 40% di ALL con Ph+ mostrano lo stesso riarrangiamento visto nella CML; i rimanenti 60% di ALL con Ph+ mostrano una proteina di 190 Kda, chiamata p190BCR/ABL.

JAK 2 sequenza exon 12

JAK2 exon12 sequencing gene bank  NM_004972

Focus F537-K539del/InsL, H538Q, N542-E543del

Sequenza sanger

10 giorni

Sullo stesso prelievo dove si esegue il pannello S mieloproliferative

Tale alterazione è stata descritta nel 5-10% circa dei casi di Policitemia Vera JAK2 V617F wild Type (Vannucchi et al. Blood 2007). In particolare le seguenti mutazioni sono state riscontrate nel 5% dei casi di sindromi mieloproliferative negative al Jak2 V617F e alla t(9;22)Bcr/Abl: (Scott et Al 2007. Mutation in Polycytemia Vera and Idiopathic Erythrocytosis  N. Engl. J. Med. 356(5): 459-468.).

Iperspressione WT1 nelle LMA

(PCR Quantitativa

WT1

Real time PCR

Aspirato midollare

Sangue,  ecc. in EDTA

a +4°C

È stata dimostrata l’elevata espressione del gene WT1 in numerose discrasie ematopoietiche, fra cui la Leucemia Mieloide Acuta (AML), anche se non si conoscono ancora i meccanismi che conducono alla sua iper-espressione

Plasmocitosi

macroglobulinemia di Waldenström (MW)

MYD88 L265P

PCR-LNA

Aspirato midollare

Sangue,  ecc. in EDTA

a +4°

la metà dei pazienti MW presenta una delezione 6q 6p21.3 e 4q nelle cellule tumorali. Nel 90% dei pazienti, è stata identificata una mutazione somatica (L265P), altamente ricorrente, nel gene MYD88 e questo potrebbe rappresentare un marker di diagnosi precoce di malattia.

Oncologia: test di diagnosi precoce e prevenzione/monitoraggio delle recidive

DNA Tumorale circolante da masse neoplastiche

quantizzazione del gene hTERT nel plasma

qReal Time-PCR

Plasma da sangue periferico in EDTA

La concentrazione media di Free Plasmatic DNA (FPDNA) misurata attraverso la quantizzazione del gene hTERT, nei controlli sani è in media di 1.2 ±0.8 ng/mL (range 0.1-2.0). Il valore soglia (cut-off) per definire la positività a tale marcatore è stato calcolato sommando alla media due volte il valore della deviazione standard, ed è stato fissato a circa 2,8 ng/mL. (Sozzi Get al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol 2003; 21: 3902-8)

TP53 sequenza

Mutazioni acquisite (somatiche) del Gene TP53  tra esone 2-esone 9

PCR + sequenza

Direttive IARC

Biopsia da tessuto tumorale compreso Sangue periferico

La biologia e le anomalie genetiche somatiche del clone Linfoproliferativo giocano un ruolo centrale nello sviluppo di chemiorefrattarietà. L’inattivazione di TP53 tramite delezione o mutazioni rappresenta la lesione genetica che ricorre più frequentemente nei carcinomi e leucemie linfatiche

Emocromatosi Ereditaria

HFE  C282Y e H63D

Ferroportina (SLC11A3) N144H e A77D

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

La maggior parte degli individui con emocromatosi (80-100%) e’ omozigote per la mutazione C282Y, mentre una piccola parte risulta essere eterozigote per le mutazioni H63D. Recentemente è stata dimostrata una trasmissione di tipo autosomico dominante a causa di mutazioni (A77D e N144H) presenti nel gene codificante per la ferroportina (SLC11A3), una proteina transmembrana responsabile del trasporto del ferro (Am J Med 1995;98:464-8).

Rischio Trombotico

Pannello  Base

Pannello base 6 polimorfismi:

MTHFR C677T

MTHFR A1298G,

FII (Protrombina)

FV Leiden

Beta-Fibrinogeno

PAI-1 4G/5G

Le mutazioni aggiuntive sono:, , , APOE, FV HR, FV YC, FVII, FXIII, HPA, MTRR, CBS, ACE I/D, HPA

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

Il pannello mira a valutare le mutazioni di maggior peso per la predisposizione genetica al rischio trombotico nei numerosi campi specialistici, come la Neurologia (rischi ictus), cardiologia (rischio infarto), Ginecologia (aborto spontaneo ricorrente e/o rischio pre-clampsia).

Favismo deficit di G6PD

(€ 350,00) in service

G6PD Introne 11  1401 T>C

Introne/esone 11 1455-13 C>T

Esone 12 1490C>g (Pro479Arg)

Sequenza completa

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

Farmacogenomica Oncologica: test di predizione di tossicità o inefficacia della terapia

Protocolli FOLFOX  (Folati 5-FU e Oxaliplatino)

5 Polimorfismi

DPYD IVS14+1G>A; rsrs3918290

DPYD A1627G rs1801159

TYMSins28bp, rs34743033

GSTP1 I105V rs1695

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

Circa lo 0’1% della popolazione caucasica presenta il polimorfismo della Diidropirimidina deidrogenasi (DPYD).Tale condizione produce un difetto di metabolizzazione delle Fluoriopirimidine con conseguente tossicità di grado>3 (aplasia e mucositi). Se sinergizzato ad altri polimorfismi come TYMS 3R/3R o difetto di detossificazione di platinati (GSTP1) questa condizione potrebbe essere addirittura letale.

Di Francia R et Al Pharmacogenetic panel test for prevention-toxicity in patiente who recieve fluoropyrimidines/oxaliplatin based-therapy Eur Rev Med and Pharmac Sci 2012; 16. 1211-

Protocollo FOLFIRI (Folati 5-FU e Irinotecan)

3 polimorfismi:

DPYDIVS14+1G>A e altri 4

TYMSins28bp,

UGTA1A TA6/7

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

Per 5-FU idem sopra; soggetti con eterozigosi  o omozigosi per 7 ripetizioni TA (sindrome di Gilbert) hanno un difetto di metabolizzazione dell’Irinotecan. Falcone A et Al. Phase III trial of infusional FOLFOXIRI vs FOLFIRI……J Clinical Oncology 2007; 25: 1670-6

Protocolli GEMOX (Gemcitabina e Oxaliplatino)

5 polimorfismi:

CDA C-451T

CDAA-92G

CDA  A79C, Lys27Gln

ERCC2 Lys751Gln

GSTP1 Iso105Val rs1695

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

La citidina deaminase è il principale metabolizzatore di Gemcitabina e Citarabina nonche di Capecitabina. I polimorfismi identificati danno informazioni sull’efficienza di questo enzima  e spiegano la inefficacia di questi farmaci nel circa il 10% dei pazienti. Kalykaki A et Al Gemcitabine plus oxaliplatin (GEMOX) in …ovarian cancer Anticancer Res. 2008 Jan-Feb;28(1B):495-500

Tossicità agli alchilanti:

5 polimorfismi:

GSTP1, rs1695

ERCC2, rs13181

XRCC3, rs1799794

PARP-1 Val762Ala rs1136410

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

L’inefficacia e la resistenza dei farmaci alchilanti è dovuta soprattutto alla capacità di riparazione degli addotti di DNA (polimorfismi su ERCC2, XRCC1 e 3, PARP1. Mentre la tossicità è dovuta soprattutto ad inefficienza dei sistemi detossificanti (GSTP1).

Tossicità ai Taxani:

5 polimorfismi:

ABCB1 3435C>T;

ABCB1 2677G>T/A

CYP3A4*22 5’UTR (rs35599367)

CYP2C8*3 K399R (rs10509681)

XRCC3 Thr241Met

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

Il target dei Taxani è la B-Tubulina (soprattutto la II e la VI). Pertanto fenomeni di resistenza si instaurano quando queste risultato alterate per determinati polimorfismi. Tale fenomeno di resistenza viene sinergizzato da iper espressioni delle proteina canale MDR (ABCB1). La tossicità neurologica dei taxani  è correlata con il CYP3A4*22 ed il CYP2C8*3 Leandro-Garcia et Al Regulatory Polymorphisms in B-Tubulin IIa… neurotoxicity . Clin Cancer Res 2012;18:4441-8

Tossicità al Metotrexate e Premetrexed

3  polimorfismi:

MTHFR C677T

MTHFR A1298G,

CYP2C8*3 K399R (rs10509681)

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

I polimorfismi della Methylen Tetra Hydrofolate reduttase correlano con tossicità  per i loro farmaci target.

Cecchin et Al A Prospective validation pharmacogenomics study… The  Pharmacogenomics Journal 2012; 1-7

Tossicità al Tamoxifen:

5 polimorfismi:

CYP 2D6*3 (rs35742686)

CYP 2D6*4,(rs3892097)

CYP2D6*5, (ricombinazione)

CYP 2D6*10(rs1065852)

CYP 2D6*XN (duplicazione genica)

TaqMan Discriminazione allelica

Tampone

Sangue ecc. in EDTA

a °T amb

Il 5-7% della popolazione caucasica è lento metabolizzatore per il CYP2D6, pertanto i farmaci che utilizzano questa tappa metabolica e con una certa tossicità devono essere adeguatamente somministrati in base alla capacità metabolica individuale .

Resistenza Ad Imatinib nelle Leucemie Mieloidi Croniche)

Ricerca delle Mutazioni (comprese le più frequenti T315I e M351T) del gene di fusione BCR/ABL negli esoni tra 4-10 di ABL

Sequenziamento diretto post RT-PCR del gene di fusione

sangue periferico o midollare in EDTA

Il 20% circa dei pz trattati con Imatinib e derivati produce resistenza a causa di mutazioni acquisite del gene target dell’Imatinib. Predire in anticipo questa resistenza permette di pianificare scelte terapeutiche alternative

Indagine

diagnostica

Geni coinvolti

Tipo di prelievo

§ Metodologia

Significativita clinica

Tariffazione*

Screening linfocitosi acuta  B

Clonalità B

VDJ

Aspirato Midollare 3 mL minimo in provette con EDTA

Sangue Periferico,

8-10mL in provette con EDTA

All’esordio nei casi di linfocitosi Acuta

€

t(9;22)(q34;q11)

BCR/ABL m-bcr

Multiplex RT-PCR

t(1;19)(q23;p13)

E2A/PBX1

conferma in Nested PCR

t(12;21)(p13;;q22)

TEL-AML1

Segue Real time-PCR in caso di positrività

Screening Mielocitosi

t(9;22)(q34;q11)

BCR/ABL M-bcr

Multiplex RT-PCR conferma in Nested PCR  Segue Real time-PCR in caso di positività

All’esordio nei casi di Mieloproliferazione Acuta

€

t(9;22)(q34;q11)

BCR/ABL m-bcr

t(9;22)(q34;q11)

BCR/ABL -bcr

t(8;21)(q22;q22)

AML1/ETO

t(15;17)(q22;q21)

PML/RARa

INV(16)(p13;q22)

CBFB-MYH11

t(6;9)(p23;q34)

DEK/CAN

Screening linfoma B

t(14,18)(q32;q21)

BCL2/IgH MBR

Aspirato Midollare e Sangue Periferico,

vedi sopra

Biospie

Come prelievo fresco almeno 0,3cm²

Raccolte in contenitore

Sterile al secco

Multiplex PCR+Nested PCR conferma in Nested PCR.  Segue Real time-PCR in caso di positrività

All’esordio nei casi di linfoproliferazione o sospetto linfoma B

€

t(14,18)(q32;q21)

BCL2/IgH mcr

t(11;14)(q13;q32)

BCL1/IgH MTC

Clonalità B

VDJ

t(11;18)(q21;q21)

API2/MLT

Screening linfoma T

Clonalità T

TCR gamma/delta

Multiplex PCR+Nested PCR

All’esordio nei casi di linfoproliferazione o sospetto linfoma T

€

Clonalità T

TCR alfa/beta

conferma in Nested PCR

t(2;5)

NPM/ALK

Indagine

diagnostica

Significativita clinica

Codice SSN (costo €)*

Free light chain Kappa

Elevate nei Linfomi

(25,00)

Free light chain Lamda

Elevate nei Linfomi

(25,00)

Elettroforesi Emoglobina

Emoglobinopatie

90.66.5 (30,00)

Eritropoietina

Eritrocitosi

(30,00)

Beta 2 Microglobulina

Linfomi

90.10.1  (15,00)

Fattore intrinseco

Anemia perniciosa

(40,00)

Fosfatasi Alcal. ossea

Mielomi, linfomi

90.24.1 (30,00)

Anti corpi anti piastrine

Piastrinopenie

90.53.3 (70,00)

LDH isoenzimi

Elevato nei linfomi

90.29.2 (40,00)

G6PDH

anemia

90.27.2 (10,00)

Omocisteina

Rischio trombotico

15,00

Folati

Anemia

90.23.2 (17,00)

Complemento C3 C4b

immunopatie

25,00

Ab Anti HTLV I/II screening

Sindrome immudeficienza

80,00

Ab anti parete gastrica

anemia

20,00

Trombossano

Piastrinopatia  aspirin-like

90.82.2 (40,00)

Vitamina B12

Anemia perniciosa

90.13.5 (17,00)

EBV IgG, IgM

Mononucleoisi

35,00

ANCA AB  citoplasma neutrofili

Neutropenie

90.48.2 (20,00)

TIBC ferro chelante

Emocromatosi

20,00

Saturazione transferrina

Emocromatosi

20,00

Recettore solubile transferrina

Emocromatosi

45,00

Transferrina Insatura

Emocromatosi

20,00

Transferrina

Emocromatosi

10,00

TIBC Capacità Ferro legante

Emocromatosi

20,00

Radicali Liberi

leucopenie

50,00

Resistenza Osmotica Eritrocitaria

Sferocitosi

90.74.3 (10,00)

Resistenza alla Proteina C attivata

Rischio trombotico

90.77.2 (15,00)

Ab anti fosfolipidi IgG IgM

Rischio trombotico

30,00

LAC

Rischio trombotico

15,00

Omocisteina plasmatica

Rischio trombotico

15,00

EBV IgG, IgM

Mononucleoisi

35,00

Indagine

Diagnostica FISH

Significativita clinica

Codice SSN (costo 400 €)

t(14,18) BCL2/IgH

70% linfomi follicolari

Linfomi e Sindromi Linfoproliferative

t(14;18)IgH/MLT1

Linfomi tipo MALT o marginali

t(8,48) IgH -cMYCr

95% linfomi di Burkitti

t(11;14) BCL1/IgH

25% Linfomi mantellari

Del 17p13.1

Leucemia Linfatica Cronica

Del13q14

Leucemia Linfatica Cronica

T(4;14)FGFr3/IgH

Mieloma Multiplo

Mielomi e  plasmocitomi

t(11;14)CCND1/IgH

Mieloma Multiplo

Del 5q-(D5S721)

Mieloma Multiplo e Leucemie Linfoblastiche  (uso Lenalidomide)

Riarrangiamento MLL (11q23)

Circa il 19% delle LLA

Leucemia acuta

INV(16) CBFB-MYH11

circa il 10% di LMA-M4Eo

Leucemie Mieloidi Acute

t(8;21) AML1/ETO

circa il 10% di LMA-M2

Cromosoma Philadelphia

circa il 99 % delle LMC e 5% LMA

t(6;9) DEK/CAN

circa il 5% di pre-LMA-M5

Trisomia cromosoma 8

Sindrome Mielodisplastica